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疏水層析ppt下載

素材大小:
71 KB
素材授權:
免費下載
素材格式:
.ppt
素材上傳:
lipeier
上傳時間:
2019-06-16 17:12:08
素材編號:
233398
素材類別:
課件PPT
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疏水層析ppt

這是疏水層析ppt,包括了實驗原理,實驗目的與要求,實驗儀器與器材,試劑與配制,清洗儀器及相關裝置,實驗相關具體條件等內容,歡迎點擊下載。

疏水層析ppt是由紅軟PPT免費下載網推薦的一款課件PPT類型的PowerPoint.

疏 水 層 析 (HIC) 一 實驗原理 疏水層析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) 是利用被分離 樣品中不同生物分子表面的疏水性差別,而將其分離純化的一種層析技術。疏 水層析的介質通常是一類在惰性支持物上接有疏水基團的層析載體,如苯基瓊 脂糖(Phenyl Sepharose), 辛基(Octyl),丁基(butyl) 瓊脂糖等。 對于不同的蛋白質和多肽而言,其分子表面一般有著不同的疏水和親水結構 區域,當將這些生物樣品加入到含有高鹽(高離子)濃度緩沖液的HIC 柱中時, 由于溶液中高濃度鹽離子與水分子的作用,降低了樣品分子的溶劑化作用,從而 增加暴露了樣品分子表面的疏水區,這樣就促使樣品分子表面疏水基團與HIC 柱 上的疏水基團相互作用結果使樣品被吸附到HIC柱上。因此疏水層析亦稱疏水相 互作用層析。樣品吸附在 HIC柱上的強弱程度,取決于樣品本身的疏水性質和樣 品環境中鹽離子的強度。 一般來說疏水性強的只需要較低的鹽濃度,疏水性弱的則需要較高的鹽濃度 [如1.0 mol/L (NH4)2SO4]。吸附在HIC柱上的生物分子,可以采用降低洗脫液中 鹽濃度的方法,使其從柱上洗脫下來,洗脫方法可以是梯度也可以是階段洗脫的 方式。樣品中不同分子被洗脫的順序依據其疏水性強與弱從先到后,從而達到分 離的目的。 二 實驗目的與要求 通過苯基瓊脂糖疏水層析柱,采用階段洗脫的方 式分離——血紅蛋白,以此了解疏水層析的原理、方法 和實際的應用。 三 實驗儀器與器材 3-1、實驗儀器 (1)、層析工作站裝置 (2)、筆記本電腦 (3)、紫外檢測儀 (4)、磁力攪拌器 (5)、恒流泵 (6)、天 平 (7)、混合器 3-2、實驗器材 (1)、 可調取液器 (2)、 量 筒 (3)、 燒 杯 (4)、 層析柱 (5)、 吸 管 (6)、 吸管架 (7)、 滴 管 (8)、 剪 刀 (9)、 鑷 子 (10)、 玻 棒 (11)、 骨 勺 (12)、 洗耳球 (13)、 稱量紙 (14)、 吸水紙 (15)、 保膜鮮 (16)、 標簽紙 (17)、 記號筆 四 試劑與配制 4-1、實驗試劑 (1)、BSA (2)、苯基瓊脂糖 (3)、磷酸氫二鈉 (4)、磷酸二氫鈉 (5)、硫 酸 銨 (6)、無水 乙醇 4-2、試劑配制 (1)、Buffer A(0.02 mol/L pH7.2磷酸緩沖液含1.0 mol/L硫酸氨)的配制: 分別稱取Na2HPO4___ 克, NaH2PO4___克和[NH4 ]2SO4___ 克于一燒杯 中,先用少量蒸餾水溶解,最后用蒸餾水稀釋至100毫升,混勻即可。 (2)、Buffer B(0.02 mol/L pH7.2 磷酸緩沖液)的配制: 分別稱取Na2HPO4 ___ 克和NaH2PO4___克于一燒杯中,先用少量蒸餾水溶 解,最后用蒸餾水稀釋至100毫升,混勻即可。 (3)、乙醇(20%)溶液: 取20.0 ml無水乙醇,然后加80.0 ml蒸餾水,混勻即可。 (4)、樣品(10mg/ml)溶液: 稱取10.0 mg BSA,加1.0 ml Buffer A溶液溶解[如有不溶物質, 需在8000rpm離心5分鐘,取上清作為上柱樣品,本品易溶]。 五 實驗步驟 5-1、苯基瓊脂糖[Phenyl Sepharose] 凝膠的處理 商品化的Phenyl Sepharose凝膠顆粒保存在20%的乙醇溶液中, 使用時取適量體積的凝膠在砂芯漏斗中用大于10倍凝膠體積的蒸餾 水充分洗滌,然后將洗凈的凝膠轉移到含有Buffer A的燒杯中。 5-2、裝柱 (1)、選擇層析柱,觀察柱底端過濾是否完好,將選擇的層析柱垂直裝好在臺 式鐵架上,關閉柱底部出口,在柱內注入少許(約1.0 cm高)洗脫液。 (2)、將燒杯中已處理好的Phenyl Sepharose凝膠,加適量的Buffer A,攪成 懸浮狀,然后沿柱內壁細心的加至一定刻度。倒入時不要太快,以免產 生泡沫和氣泡。 (3)、待樹脂在柱子底部有明顯沉積(10分鐘左右)后,慢慢打開柱底部的出 口,或用吸管吸去柱內上層過多的平衡液,繼續向柱內加入懸浮的樹脂 直至沉積后柱床體高度為3.0厘米為止。 (4)、在裝柱時要避免使柱內液體流干而使裝柱失敗。另外樹脂懸浮液的溫度 要相對恒定或應與室溫接近,否則柱床體內易產生氣泡而影響層析效 果。 (5)、檢查層析柱是否裝好。裝好的層析柱應該沒有“紋路”,節痕和氣泡,并 且柱床體表面平整而均勻。這樣方可投入使用,否則需要按上述步驟 (1-4)重新裝柱直至達到要求為止。 (6)、在裝柱的同時應將其他儀器設備接通電源,并按實驗要求進行調試。 5-3、平衡 用5倍床體積的Buffer A緩沖液,以0.5 ml/min的流速,平衡30分鐘,方可。 5-4、加樣 (1)、移去層析柱上端出口塞,打開層析柱底端出 口,小心使層析柱內液體流至層析柱床體表 面時即行關閉。 (2)、用自動取液器吸取樣液1.0毫升沿柱內壁緩 慢地加入柱中,以免沖壞樹脂表面。加樣完 畢后,慢慢打開層析柱底端出口,使液面 流至與樹脂表面相平時即行關閉。 5-5、洗滌 用自動吸管(或滴管)吸取適量(1.0ml)平衡液,重復上樣方法反復洗滌層析柱內壁四周2-3次,當最后一次洗脫液面流至與樹脂表面相平時即行關閉柱底端出口。然后再加入3.0 cm 高Buffer A緩沖液。 接上恒流泵,仍以0.5 ml/min的流速,繼續用Buffer A緩沖液洗滌直至穿過峰(第一個小峰)回到紫外檢測儀基線,并穩定約10分鐘后為止。 5-6、洗脫 (1)、用Buffer B溶液洗脫凝膠柱: 吸去柱內多余的平衡液,緩慢加入3.0 cm 高Buffer B洗脫液(防止柱 面的破壞),用恒流泵以同樣的流速0.5ml/min,進行洗脫直至所出現 的峰(第二個大峰)回到紫外檢測儀基線并穩定約10分鐘后為止(此峰 為血紅蛋白組分)。 (2)、用蒸餾水洗滌凝膠柱: 吸去柱內多余的洗脫液,緩慢加入3.0 cm 高蒸餾水(防止柱面的破 壞),用恒流泵以同樣的流速0.5ml/min,進行洗滌直至所出現的峰回 到紫外檢測儀基線并穩定 約10分鐘后為止。 (3)、用20%乙醇溶液洗滌凝膠柱: 吸去柱內多余的蒸餾水,緩慢加入3.0 cm 高20%乙醇溶液(防止柱面的 破壞),用恒流泵以同樣的流速0.5ml/min,進行洗直至所出現的峰回 到紫外檢測儀基線并穩定約10分鐘后為止約6倍床體積,40分鐘。 5-7、保存和打印實驗結果 將實驗結果保存到老師規定的文件中,同時打印實驗結果 (結果見圖1),并給出結論性的結果(見實驗結果1)。 5-8、清洗儀器及相關裝置 (1)、先從儀器裝置中移去層析柱,并回收柱內Phenyl Sepharose凝膠,然后 用自來水沖洗層析柱,洗凈后的層析柱再用蒸餾水蕩洗一遍,方可。 (2)、將紫外檢測儀比色管道的出口端(上部)與所用其他管道相連接,再把 恒流泵管道的進口端放入一干凈盛有蒸餾水的燒杯中,同時將另一燒杯 放在管道的出口端,收集流出的廢液。啟動恒流泵,沖洗管道15分鐘, 方可。 5-9、結束本次實驗 將所有的儀器設備的電源開關關閉,完畢后,清洗所有用具和臺面。 6、實驗結果 6-1、Phenyl Sepharose 凝膠分離牛血紅蛋白結果 Phenyl Sepharose 凝膠分離牛血紅蛋白曲線圖 疏水層析(HIC) 實驗相關具體條件 (1): 凝膠名稱: 苯基瓊脂糖[Phenyl Sepharose] 凝膠 (2): 柱 高: 3.0 cm; (3): 流 速: 0.5 ml/min (4): 平衡時間: 30 min(或5倍床體積) (5): 平 衡 液: Buffer A: 0.02 mol/L pH7.2磷酸緩沖液含1.0 mol/L硫酸氨 (6): 洗 脫 液: Buffer B: 0.02 mol/L pH7.2磷酸緩沖液 (7): 樣品名稱: 牛血清白蛋白 (8): 樣品濃度:牛血清白蛋白 4.0 mg/ml Buffer A (9):上 樣 量: 1.0 ml (10): 檢測波長: 280 nm, (11): 靈 敏 度: 0.5 A(0.2—0.5A)

疏水閥工作原理動畫PPT課件:這是一個關于疏水閥工作原理動畫PPT課件,包括了機械類-倒置桶型、杠桿浮球型,熱靜力類-壓力平衡式/波紋管、膜盒、固體膨脹式/雙金屬片型,熱動力類-圓盤等內容,疏水閥的主要型式 1.機械類倒吊桶型浮球型自由半浮球型 2.熱靜力類壓力平衡式/波紋管、膜盒固體膨脹式/雙金屬片型液體膨脹式/恒溫疏水閥 3.熱動力類圓盤 5. 疏水閥的主要型式 1)機械類-倒置桶型倒置桶疏水閥拋開樣工作原理動作過程 5.1 倒吊桶疏水閥 a)剖開樣蒸汽將桶浮起 桶將閥瓣移向閥座 壓差使閥瓣輕輕坐入閥座 5.1 倒置桶疏水閥 b)工作原理-排水 5.1 倒置桶疏水閥 b)工作原理-排空氣 5.1 倒置桶疏水閥 b)結構特點-持久密封 5.1 倒置桶疏水閥 c)動作過程 5.1 倒置桶疏水閥 c)動作過程-空氣流動路線 5.1 倒置桶疏水閥 c)動作過程-排水路線,歡迎點擊下載疏水閥工作原理動畫PPT課件哦。

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